1 - LES CONCEPTS DE DEPART

a- UN ÊTRE MULTICELLULAIRE: L'HOMME

Nous sommes faits de milliards de cellules d'aspects et de fonctionnements extrêmements variés. Toutes ces cellules, aussi étonnant que cela puisse paraitre, sont issues de la même cellule initiale : la cellule-oeuf issue de la rencontre d'un ovule et d'un spermatozoïde. Puis le développement et la formation de l'homme résulte de divisions multiples et successives de cette cellule initiale, d'une différenciation progressive de ces cellules descendantes en plusieurs centaines de types cellulaires différents.

Ces cellules, selon leur type de diversification s'organiseront en tissus, en organes, en un organisme. Cela s'appelle la différenciation cellulaire et la morphogénèse.

Cette capacité est propre aux cellules eucaryotes : ce sont des cellules qui possèdent une information génétique, l'ADN, le génôme contenu dans un espace réduit, spécifique et séparé du reste de la cellule : le noyau.

Il parait difficile, même si cela est la réalité, d'imaginer que des cellules d'aspects et de fonctions aussi différents qu'une cellule hépatique, une cellule sanguine, un neurone, une cellule musculaire soient porteuses du même génôme qu'elles ont toutes hérité de la même cellule initiale. Elles vont, en fait, utiliser différemment les potentialités de ce génôme. Chacune possède un répertoire de gènes, qu'elle décide d'utiliser ou non et ceci de manière définitive. Elles transmettront cet usage particulier du génôme aux cellules de sa descendance.

En plus clair, les cellules ont toutes la même bibliothèque de livres, mais elles ne lisent pas les mêmes livres et/ ou pas à la même fréquence. Et les cellules-filles, issues de leurs divisions, hériteront du goût des mêmes livres.

Quelques chiffres : en terme de gènes, on estime qu'en gros :

Environ 10 000 gènes sont exprimés dans toutes les cellules de l'organisme. On parle alors d'expression ubiquitaire. Il s'agit des gènes dits domestiques, qui codent pour les fonctions d'entretien de la vie cellulaire.

20 à 50000 gènes sont exprimés seulement dans certains tissus, voire dans un seul. On parle ici de gènes d'expression tissu-spécifique.

Autrement dit, 75 à 90 % des gènes sont exprimés dans la plupart des types cellulaires, les autres font la différence qualitative et confèrent à la cellule son identité différenciée.

Les premiers concepts sur le fonctionnement des gênes sont apparus, il y a quelques dizaines d'années avec au départ l'étude de la bactérie Escherichia coli. On a pu découvrir que l'information génétique était constituée par quatre types de radicaux chimiques, les bases, se succédant les uns à la suite des autres tout au long d'une immense molécule d'ADN, organisée en double hélice dans l'espace. C'est là qu'apparaît la notion de gène, unité d'information génétique, et en fait segment de cette molécule d'ADN.

Cette information génétique est ensuite transformée en information pratique : l'ARN messager puis la protéine et l'ensemble des protéines ainsi formées font la spécificité des êtres vivants. Une seule protéine manquante déficiente ou aberrante peut entrainer des conséquences graves sur un organisme.

Il existe aussi de multiples mécanismes de régulation :

Les gènes, mêmes s'ils occupent une partie infime de l'ADN total de la cellule, sont donc déterminants pour le bon fonctionnement de notre organisme.

b- GENETIQUE ET CANCER :

Il semblerait exister, pour 5 à 10 % des cancers, des prédispositions héréditaires.

Les cellules tumorales acquièrent pour la plupart des anomalies génétiques et, on peut donc penser aujourd'hui que la part des cancers acquis reste donc essentielle, mais que, cependant, la constitution génétique influence le développement de la majorité des cancers.

On voit aujourd'hui qu'il est difficile de distinguer cancer et génétique. C'est pour cette raison qu'il est nécéssaire de connaitre quelques notions de génétique avant de parler de cancérogénèse.

Les cellules mènent une existence régulée par les besoins de l'organisme et s'adaptent à sa demande dans la limite de leurs possibilités.

Les cellules tumorales mènent, elles, une existence indépendante des nécessités de l'organisme et évoluent pour leur propre compte : elles ne répondent plus aux stimuli physiologiques en proliférant, forment des tumeurs en envahissant et détruisant l'architecture des tissus sains adjacents, et peuvent essaimer à distance en formant des métastases.

Les cellules malignes descendent toutes d'une cellule normale, transformée par une cascade d'évenements et ceci sur plusieurs générations de cellules.

Certaines de ces étapes consisteraient en une altération, transmissible dans la descendance (par un mécanisme génétique), du fonctionnement de gènes-clés appartenant à 2 familles : celles des oncogènes et des anti-oncogènes

Les oncogènes seraient des gènes conférant à la cellule une activité de prolifération. Ils servent à coder des facteurs de croissance et leurs recepteurs, ainsi que des protéines servant à la division cellulaire.

Normalement, ils serviraient essentiellement lors de la période embryonnaire, et en dehors de cette période normale de croissance cellulaire, leur activation, par exemple à la suite d'une translocation, serait susceptible d'entrainer une synthèse excessive de la protéine correspondante.

Cette protéine permettrait à la cellule d'échapper aux systèmes de régulation habituels et contribuerait à la transformer en cellule maligne.

Les anti-oncogènes ou gènes suppresseurs de tumeurs, eux, pourraient entrainer une progression tumorale lorsqu'ils sont abolis. C'est à dire que ce serait des gènes qui interviennent dans la sauvegarde du patrimoine génétique.

Par exemple, au décours d'une lésion du matériel génétique lors d'une agression (irradiations), il existerait un arrêt de prolifération des cellules lésées.

Deux solutions semblent se profiler pour la cellule ainsi lésée : soit réparation du matériel génétique et pousuite du cycle cellulaire, soit mort cellulaire ou apoptose.

Et si la protéine codée par l'anti-oncogène est anormale ou manquante, ce système de régulation pourrait ne plus se déclencher et la cellule, non réparée, se diviserait en cellules anormales.

c- THERAPIE GENIQUE (TG)

Premier concept développé : c'est celui de la réparation des gènes entraînant une maladie. C'est-à-dire une thérapie des gènes permettant la correction du phénotype par réparation de l'anomalie génique.

C'est l'opération idéale par correction in-situ avec un gène réparé restant dans son environnement naturel et demeurant soumis à ses propres mécanismes de régulation.

Mais cet objectif paraît difficile aujourd'hui, car on ne sait pas encore réparer spécifiquement une lésion donnée dans un gène donné.

Deuxième concept : laisser le gène muté et apporter un gène fonctionnel.

Comment va se comporter ce gène fonctionnel ?

- Son but est de suppléer le gène défectueux.

- C'est une intégration aléatoire.

- Problème de la perte de sa régulation, sauf si on peut le flanquer de ses séquences régulatrices.

- Ce gène fonctionnel peut être non intégré et rester sous forme épisomal.

Génothérapie germinale : manipulation du génome constitutionnel par correction dans une cellule germinale ou dans une cellule de l'embryon précoce, entraînant une transmission à la descendance. Cette génothérapie est inapplicable à l'homme pour des raisons techniques et éthiques. Elle constitue actuellement un modèle animal (souris transgénique).

Génothérapie somatique : c'est la correction phénotypique d'un groupe cellulaire déterminé et de sa descendance sans toucher au patrimoine génétique constitutionnel. Du point de vue éthique, cela correspond à une greffe ou à une transplantation.

3- BUT DE LA THERAPIE GENIQUE ET NOTION DE GENE-MEDICAMENT

Le transfert de gène proposé pour autre chose que le traitement d'une maladie n'est pas à considérer comme une thérapie génique.

La seule exception sont les gènes marqueurs introduits dans l'intention de développer les modèles de traitement, permettant d'étudier la faisabilité du transfert et l'expression in vivo des gènes transférés. En bref, ils permettent de repérer une cellule par un marquage spécifique.

Dès lors la thérapie génique devient l'utilisation du gène comme un nouveau type de médicament qui pourrait déborder sur les indications actuelles de maladies génétiques, puisqu'un gène-médicament peut, en principe, remplacer n'importe quel médicament protéique dont il pourra contrôler la synthèse et la délivrance dans l'organisme lors d'une pathologie.

Quelle que soit la stratégie employée et la pathologie à traiter, on essaie toujours de rester aussi près que possible des conditions physiologiques. Cette stratégie du transfert d'un gène à visée thérapeutique ou de marquage cellulaire comporte des exigences.

1- LE GENE D'INTERET

La première exigence est de disposer du bon gène d'intérêt (transgène), ce qui est possible aujourd'hui dans beaucoup de maladies héréditaires où le gène muté, responsable de la maladie, est connu.

On utilise en général des constructions comportant: le gène à greffer, muni de différents éléments de contrôle assurant un bon niveau d'expression (promoteur fort, séquence de type enhancer). Ces constructions sont effectuées soit dans un vecteur plasmidique, soit le plus souvent dans un vecteur viral.

Cette expression peut être :

- 1) permanente, temporaire ou induite ;

- 2) dans toutes les cellules ou dans un type cellulaire donné (= ciblage transcriptionnel) ;

exemple : le transgène de l'insuline transféré pour un diabète insulino-dépendant devra répondre au taux de glycémie.

La construction finale peut être très élaborée. Elle est améliorée progressivement par les études d'expression dans les cellules en culture puis chez les modèles animaux.

Il est difficile de définir une stratégie générale permettant de prévoir la construction idéale, le niveau d'expression et la stabilité du transgène ; car il existe des interférences entre le transgène, le vecteur ayant intégré le gène, l'environnement où ce vecteur est transféré, la cellule productrice du vecteur, la cellule-cible.

2- LE SYSTEME DE TRANSFERT

C'est le problème majeur, il correspond au problème de galénique du pharmacologue.

Un médicament peut être efficace in-vitro, mais la plus grande difficulté reste à connaître sa bio-disponibilité dans l'organisme. Comment rendre ce produit facile à capter sur la cible visée, et qu'il soit actif après la pénétration intra-cellulaire ?

D'où la notion que ce gène-médicament doit être "vectorisé" vers la cellule cible.

On dispose pour se faire de différents outils :

- les vecteurs viraux

- les vecteurs non viraux

Trois vecteurs viraux ont été particulièrement étudiés jusqu'ici :

- les rétrovirus (RV)

- les adénovirus

- les AAV (adeno-associated virus)

Les vecteurs rétroviraux restent l'outil de base pour obtenir un bon transfert, et une expression stable d'un transgène thérapeutique. Ils seront développés dans ce cours.

3- LA CELLULE CIBLE

La stratégie comporte deux temps :

- transfert dans des cellules en culture

- réintroduction dans l'organisme des cellules efficacement greffées.

La greffe de gènes a d'abord été effectuée sur des cellules hématopoiétiques, maintenant d'autres types cellulaires sont utilisées comme cible : fibroblastes, kératinocytes, hépatocytes, myoblastes.

Les cellules cibles sont prélevées, génétiquement modifiées ex-vivo, puis greffées. Il s'agit donc du point de vue cellulaire d'une autogreffe, même si le gène greffé appartient à une espèce différente. Des modèles animaux naturels et transgéniques permettent de tester in-vivo cette nouvelle thérapeutique, puis de débuter les essais cliniques éventuels chez l'homme.

Pour certaines pathologies, il n'est pas possible de traiter ex-vivo les cellules cibles, telles que les cellules des glandes exocrines des patients atteints de mucoviscidose. L'accessibilité de la muqueuse des voies respiratoires en fait un modèle privilégié pour les essais de thérapie génique directs in-vivo. On utilise là le vecteur adénoviral, efficace pour infecter un grand nombre de type cellulaire, et pour introduire un nombre élevé de copies du vecteur, sans que la cellule soit altérée. La preuve du transfert et de l'expression du gène CFTR a été obtenue chez l'animal et chez les patients, avec des essais thérapeutiques utilisant des aérosols. Les problèmes actuels sont des réactions immunologiques rendant inefficaces les réinjections des vecteurs.

4- L'EVALUATION THERAPEUTIQUE IN VIVO

En pratique, si la greffe génique est en général obtenue dans les cellules en culture (ex-vivo), celle-ci est moins efficace après réimplantation chez l'animal entier (in-vivo). L'extinction de l'expression du greffon est due à des causes multiples.

Prenons comme exemple celui de la b -thalassémie ; l'idée de départ était d'ajouter de l'ADN de globine b à des cellules de la moelle osseuse, grâce à un vecteur rétroviral porteur de ce gène. L'expression élevée de ce gène transféré fut obtenu après culture avec des cellules MEL (murine-erythro-leukemia).

L'efficacité fut ensuite prouvée in-vivo avec la génothérapie germinale permettant de guérir la souris thalassémique. Mais en thérapie somatique, l'expression de ce gène s'est révélée insuffisante avec une expression du transgène de globine b modeste, limitée à un faible nombre de cellules et diminuant avec le temps. Il convient donc d'améliorer principalement trois obstacles :

a) le vecteur rétroviral dont certaines séquences réduisent l'expression du gène b

b) les cellules souches hématopoiétiques. Il faudrait pouvoir idéalement infecter exclusivement les cellules souches pluripotentes (0,01 % de la population des cellules médullaires), et réduire la dilution des cellules génétiquement modifiées ex-vivo puis greffées (aplasie médullaire avant autogreffe ? duplication ex-vivo de ces cellules souches ou adjonction d'un gène leur donnant un avantage de sélection in-vivo ?)

c) le niveau d'expression du transgène.

Les vecteurs rétroviraux restent l'outil de base pour obtenir un transfert et une expression stable d'un transgène thérapeutique. Mais leurs limites sont les faibles titres viraux obtenus et leur inefficacité sur les cellules non en division.

Quant aux vecteurs adénoviraux, ils posent un problème pour les thérapies géniques prolongées, compte-tenu du caractère non réplicatif de leur génome.

De plus, ils sont handicapés par leur immunogénicité résiduelle, limitant à quelques semaines l'efficacité des transgènes qu'ils véhiculent.

Quoi qu'il en soit, immunogénicité et instabilité, associées à une faible infectiosité dans les conditions pathologiques réelles expliquent le caractère décevant des essais de thérapie génique des mucoviscidoses avec l'adénovirus.

5- LA SECURITE

Il existe actuellement une réticence à utiliser les rétrovirus in-vivo pour des raisons de sécurité liées à l'insertion au hasard de l'ADNc proviral dans l'ADN chromosomique. Il se pose de plus le problème des éventuels virus recombinants et compétents pour la réplication. Malgré tout, les résultats des études cliniques (environ 200) paraissent rassurants avec une bonne sécurité des vecteurs et l'absence d'effets secondaires délétaires, directement liés au transfert de gènes.

1- L'ADN NU

L'injection chez l'animal d'un plasmide contenant des séquences nécessaires à l'expression d'une protéine d'ADN plasmidique, déclenche une réponse immunitaire cellulaire et humorale.

Tout d'abord, il n'est pas nécessaire de recourir à des méthodes sophistiquées pour faire entrer, in-vivo, l'ADN dans les cellules. Il suffit d'injecter directement l'ADN, par voie intra-musculaire, ou par un "fusil à gènes" (gene gun) qui bombarde l'épiderme avec des micro-particules recouvertes d'ADN. Ainsi, un plasmide, contenant des séquences nécessaires à l'expression d'une protéine, peut atteindre le noyau cellulaire où il est transcrit, et l'ARN correspondant subit le destin commun des transcrits cellulaires, sa traduction en protéines. Ce qui est source d'étonnement, c'est que cette protéine "étrangère" peut déclencher une puissante réponse immunitaire, équivalente à celle provoquée par une infection virale.

Ceci ouvre la voie à une nouvelle stratégie d'immunisation par administration d'ADN nu et aborde le problème d'une nouvelle technologie vaccinale qui présente de nombreux avantages par rapport aux méthodes classiques : simplicité, efficacité, coût réduit.

Les espoirs sont nés des modèles animaux avec en particulier une immunisation par l'ADN du virus de l'hépatite B, du VIH type I, de la malaria et du paludisme. Ces modèles ont montré que la vaccination par l'ADN réussit à déclencher une réponse immunitaire efficace à un stade très précoce de l'infection.

Des essais cliniques de phase I sont en cours pour traiter des malades atteints de cancers, et d'autres sont prévus pour des personnes séro-positives pour le VIH.

Différents risques potentiels concernant la sécurité de cette approche vaccinale restent encore à évaluer pour qu'elle puisse être utilisée de manière généralisée, c'est à dire pour vacciner des individus sains.

L'ADN nu vaccinant est beaucoup plus stable que les protéines vaccinantes, facile à purifier et peu coûteux à produire en grande quantité. Il est probablement promis à un grand avenir si on confirme l'absence de son intégration dans le génome de rares cellules, et l'absence d'effet immunitaire indésirable (induction de tolérance, auto-anticorps, hyperimmunité).

Une meilleure connaissance fondamentale des mécanismes du transfert de l'ADN, de l'expression transitoire des gènes, de leur activation et de leur inactivation secondaire, ainsi que l'utilisation d'ADN associé à des molécules cationiques, ou permettant un transfert aux muqueuses, devraient faire évoluer ce domaine d'application très activement développé.

2- LES COMPLEXES MOLECULAIRES ET LIPOFECTION

Pour améliorer l'efficacité du passage de la membrane plasmique par l'ADN, toute une série de vecteurs non viraux est en cours d'étude. L'idée de départ est que l'ADN étant chargé négativement ainsi que la membrane cellulaire, l'addition de charges positives sous forme de polylysines ou de lipides cationiques permet d'une part de neutraliser les charges d'ADN et d'autre part d'augmenter la liaison du complexe à la membrane.

Pour améliorer l'efficacité du transfert intra-cytoplasmique, d'autres systèmes sont additionnés à ce complexe :

- l'addition de protéines telle que la transferrine favorisant le transfert du gène d'intérêt dans les vésicules d'endocytose.

- protéines d'enveloppe virale (fusiogène) améliorant le transfert de l'ADN dans le cytosol.

- adjonction de chloroquine, molécule déstabilisant les endosomes permettant un éclatement des vésicules et libérant ainsi le gène d'intérêt de manière plus efficace.

Ces vecteurs synthétiques de l'ADN représentent une alternative avantageuse par rapport au virus pour différentes raisons :

- même vecteur quel que soit le gène thérapeutique

- absence de limite théorique à la taille de l'ADN transfecté

- absence de réponse immunologique

- pas de risque de recombinaison virale

- simplification de la production.

L'inconvénient majeur de ce type de vecteur est leur manque d'efficacité, particulièrement in vivo et sur les cellules quiescentes.

3- LES VECTEURS VIRAUX

Leur efficacité est nettement supérieure. Ils sont introduits dans la cellule tout en transportant le matériel génétique. La transcription est effectuée en détournant le métabolisme cellulaire à leur avantage.

Le principe est d'enlever certaines séquences du génome viral et d'y introduire le gène d'intérêt.

Les virus utilisés sont soit des virus DNA tels que l'AAV, le SV40, l'adénovirus, l'herpès simplex virus, et le virus de la vaccine, soit des virus ARN, tels que les rétrovirus (RV) (murine leukemia virus, avian leukemia virus, ou des lentivirus tel le HIV), le polio virus ou le virus influenzae.

La place de ces derniers dans les protocoles actuels (décembre 1995) est importante avec 150 à 200 protocoles avec un vecteur rétroviral, 15 à 20 avec un vecteur adénovirus, 10 à15 avec des liposomes, 2 avec du DNA nu et 1 avec l'Adéno-Associated Virus.

Les RV sont des virus à ARN ayant une réplication particulière avec un intermédiaire comportant de l'ADN.

Ces virus vont s'intégrer dans un génome hôte, modifiant définitivement la cellule.

Ce sont des ARN simple brin codant pour une enzyme particulière : la reverse transcriptase (RT). Cette enzyme est couplée à une intégrase (permet l'intégration du provirus dans le génome de l'hote), le tout dans une capside.

L'organisation génétique : ce génome rétroviral a une taille moyenne de 7 à 12 Kb avec une répétition terminale nommée LTR (long terminal repeat), possédant un rôle de promoteur et d'intégration provirale dans l'ADN cellulaire.

Entre les deux, les gènes, toujours dans le même ordre, quel que soit le RV :

- GAG codant pour les protéïnes de capside et les protéïnes de matrice

- POL : protéase, réserve transcriptase (RT) et intégrase

- ENV : protéïnes d'enveloppe.

Les virus humains tels que HIV et HTLV se compliquent par l'apparition d'autres gènes, régulateurs et ayant des fonctions de transactivation, tels que TAX, REV, REX.

Une enzyme spécifique du rétrovirus est importante à connaitre, c'est celle de la RT : à partir d'un simple brin d'ARN, elle synthétise un hybride ARN-ADN, dégrade le brin d'ARN par une activité RNase H, puis copie un simple brin complémentaire permettant d'obtenir un ADN double brin.

La réplication d'un rétrovirus comprend deux phases, celle d'une pré-intégration et celle d'une post-intégration.

Pour le vecteur rétroviral, on enlèvera une partie du génome avec un remplacement par le gène thérapeutique. Tout le reste du cycle de réplication est identique.

La première phase comprend une reconnaissance des récepteurs à la surface de la cellule cible, permettant une fusion des membranes et de la couche lipidique.

Une fois le matériel génétique dans le cytosol, le milieu devient propice à l'activité RT qui est stimulée, permettant le passage de l'ARN simple brin à l'ADN double brin.

Le transport ensuite de l'ADN proviral va se faire dans le noyau avec intégration dans le chromosome. Les rétrovirus murins accèdent à la chromatine de façon passive : ils attendent la mitose pour pouvoir rentrer en contact avec la chromatine et s'intégrer. Pour les lentivirus (HIV) le complexe préintégratif est différent. Il existe une interaction avec le système de transport nucléaire et l'ADN peut donc s'intégrer même dans les cellules non en division. C'est donc un système particulier avec une intégration sans réplication de l'ADN.

Cette intégration se fait au hasard avec le risque d'activation d'un oncogène au voisinage du site d'insertion dans les cellules ciblées. Ce risque est faible, en cas d'insertion aléatoire du vecteur classique, il est encore diminué par l'obtention de vecteurs auto-inactivés.

La deuxième phase post-intégration : le provirus va se comporter comme un gène cellulaire avec transcription, assemblage, maturation et relargage. Pour le vecteur proviral, il n'existe pas de production de particules rétrovirales compte-tenu de leur construction.

Comment passe-t-on du virus sauvage au vecteur ?

La plupart des vecteurs rétroviraux utilisés ont été développés sur le modèle amphotrope (c'est à dire possédant des protéines de l'enveloppe virale permettant d'élargir la spécificité d'infection aux cellules humaines) et sont construits pour être incompétents pour la réplication.

La TG rétrovirale est basée sur une idée simple: faire porter le gène thérapeutique par un vecteur rétroviral qui pénètrera dans la cellule cible et s'intègrera sous forme d'ADN proviral dans le génome cellulaire. Ce système met donc ingénieusement à profit les particularités des rétrovirus. Les deux virus naturels de départ utilisés ont été le virus murin de moloney (Mo-MLV) et le virus aviaire.

Les fonctions essentielles qui devront être réalisées au cours de ce processus sont donc :

L'approche expérimentale, retenue par la communauté scientifique en TG, consiste en l'utilisation d'un vecteur rétroviral défectif pour la réplication virale qui sera complémenté en trans pour les fonctions GAG, POL, ENV (virus helper) par une lignée cellulaire d'encapsidation. Ces dernières fonctions permettent à la cellule d'encapsidation (fibroblastes de souris) de produire des particules vides véhiculant l'ARN vecteur.

Le vecteur proprement dit conserve les séquences cis régulatrices indispensables : les LTR pour le contrôle de la transcription et de l'intégration, y pour l'encapsidation et PBS (Primer-Binding Site) pour la réplication virale.

Seules les séquences d'ARN porteuses d'une séquence y pourront être encapsidées. Les gènes GAG, POL, ENV sont délétés et remplacés par le gène d'intérêt.

La particule virale utilisée comme vecteur thérapeutique est aisément produite en grande quantité par une lignée productrice transcomplémentante ayant intégré dans des sites différents de ce génome, d'une part le virus helper et d'autre part le vecteur sous forme d'ADN proviral. Le but est de mettre cet ARN vecteur, porteur du gène thérapeutique, dans les particules vides pour ensuite se diriger vers la cellule cible. Parfois, est ajouté un autre gène servant de marqueur de sélection.

Ce système est conçu pour empêcher toute propagation ultérieure. Le risque d'obtenir des ARN réplicatifs par recombinaison-complémentation, devient de plus en plus faible avec les nouvelles générations de cellules productrices de vecteurs.

Les conditions d'obtention de titres élevés de particules infectantes, porteuses du transgène, progressent rapidement. Il devient également possible de concentrer le surnageant des cultures de cellules productrices, pour améliorer l'efficacité de l'infection, et de conserver des lots importants de vecteurs fonctionnels.

Enfin, le changement de protéines de l'enveloppe virale a permis d'élargir la spécificité à l'infection de cellules humaines (vecteur amphotrope) et à d'autres types cellulaires. Le choix des vecteurs rétrovirus est porté actuellement sur :

- l'efficacité du transfert

- l'inocuité de l'infection

- l'intégration stable du provirus recombinant dans une configuration définie

- le transfert et l'expression stable du gène.

La TG en cancérologie consiste à tenter d'améliorer les défenses de l'organisme contre les cellules tumorales en sachant utiliser parfois leurs propres armes. Il s'agit donc de transférer des gènes utiles pour la destruction de ces cellules, comme un "cheval de Troie" ou bien de restituer à l'organisme atteint les gènes déficients de manière qualitative ou quantitative.

Trois approches principales seront développées, basées sur des applications potentielles en cancérologie:

1- L'immunothérapie, ou immunomodulation : il s'agit de rendre sensible une cellule tumorale à des cellules immunocompétentes.

2- L'utilisation d'anti-oncogènes comme le gène de la p53 ou du rétinoblastome.

Les protéines normales de ces gènes seraient capables de reconstituer l'action suppresseur de tumeur attendue, lorsque les gènes initiaux sont délétés ou mutés.

3- L'utilisation de gènes sensibles à des médicaments et capables d'induire une réaction cytotoxique après transformation par une enzyme spécifique. Ce sont les gènes dits "suicides", dont le plus connu est celui de la thymidine kinase du virus herpes simplex (HSV-TK).

A part, mais ayant une implication dans les services de cancérologie, se situe la thérapie génique concernant les cellules de la moëlle osseuse.

1- Approche d'une immunothérapie

L'élimination immunologique des cellules malignes peut être induite, soit par la modification génétique des cellules malignes dans un but de vaccination, soit par activation du système immunitaire grâce au transfert de gènes.

Les premiers essais thérapeutiques en 1990, par Rosenberg et al, ont concerné des patients atteints de mélanomes métastatiques. Ils ont vérifiés d'abord le ciblage tumoral des TIL (tumor-infiltrating lymphocytes), munis d'un gène marqueur, le gène néo. Après injection par voie intraveineuse des TIL porteurs du gène marqueur, ils ont démontré, par PCR, que les TIL transfectés,étaient présents pendant plusieurs semaines dans le tissu tumoral et les métastases.

Ils ont ensuite chercher à "armer" ces lymphocytes en y intégrant un gène codant pour IL2 ou TNFa . Ces lymphocytes activés et amplifiés ex vivo après intégration du gène d'intérêt ont été injectés chez des patients atteints de mélanomes, mais les résultats thérapeutiques ont été décevants.

Depuis, d'autres essais cliniques, utilisant le transfert de cytokines (IL2, IL7, GM-CSF, IL4, IL12 etc ...) dans des cellules tumorales autologues, ont été réalisés mais les résultats restent médiocres

D'autres essais continuent, en utilisant des marqueurs spécifiques des tumeurs et des cytokines intégrés dans d'autres types de vecteurs (ex: virus de la vaccine) afin de détruire spécifiquement la masse tumorale.

La TG du SIDA comporte des essais actuels consistant en une tentative de reconstitution génétique des défenses cellulaires antivirales naturelles avec l'IFNa . C'est ainsi que l'équipe de J. Hopkins (USA) a démontré qu'une lignée de lymphocytes T CD4+ humaine infectée par ce vecteur rétroviral était résistante à la réplication du virus VIH. Ces essais ont obtenu des réponses encourageantes in vitro et chez l'animal, mais il reste prématuré de préjuger de leur réelle efficacité en clinique humaine.

2- Anti-oncogènes :

La transformation maligne est souvent associée à l'inactivation d'un anti-oncogène tel que le gène de la p 53, muté dans 50 % des tumeurs humaines.

Nous avons vu que ce type de mutation confère à la cellule maligne un avantage de prolifération, une réduction de la correction des erreurs de l'ADN, et la suppression de la mort cellulaire programmée (apoptose).

In vitro, il a été démontré que le transfert de la forme normale de p 53 et son expression dans les cellules présentant des mutations inactivant p 53 permet de ralentir leur prolifération et rétablit l'apoptose des cellules anormales.

Par exemple, en 1995, Roth et son équipe ont effectué un essai de phase I chez un homme de 60 ans atteint de carcinome pulmonaire non résécable, sans espoir d'efficacité avec la radiothérapie et la chimiothérapie. Il a été traité par injection intra-tumorale (bronchoscopie) d'un vecteur rétroviral transfecté avec p 53.

La présence du marqueur néoR (gène de résistance à la néomycine) a permis de le détecter dans environ 40 % des cellules d'une biopsie effectué 24 heures après.

Le cinquième jour, les lésions avaient commencé à régresser au sein d'une fibrose inflammatoire non cancéreuse. Aucune toxicité n'a été observée. Après un mois, la tumeur a régressé à 87 %.

Ceci a été prouvé dans d'autres lignées humaines dérivées de cancer (ex : cancer du col et human papilloma virus) et chez l'animal avec d'autres anti-oncogènes (Rb, p 16...) mais la destruction des cellules tumorales resterait apparemment dans ce type d'application du mécanisme de l'apoptose.

Il parait aujourd'hui difficile de démontrer l'efficacité réelle de cette TG compte tenu de la difficulté à entrevoir tous les mécanismes agissant réellement.

3- Les gènes suicides

On utilise là un système ingénieux, mettant à profit le fait que certains gènes sensibles à certains médicaments soient toxiques pour une cellule l'exprimant, après transformation par une enzyme spécifique. Parmi ces gènes, désignés "gènes suicides", le plus connu est celui codant pour une enzyme, la thymidine kinase (TK) du virus Herpes simplex.

Cette enzyme peut métaboliser les dérivés de l'aciclovir (ganciclovir) en un composé toxique pour la cellule. Une cellule, exprimant la protéine codée par ce transgène, va périr si elle incorpore du ganciclovir et si elle se divise.

Le tissu cérébral sain est un tissu se divisant faiblement et donc intégrant peu le vecteur rétroviral. L'idée a donc consisté à injecter dans la tumeur par stéréotaxie un milliard de fibroblastes murins ayant intégré le vecteur rétroviral de la TK. Le ganciclovir est ensuite administré par voie intraveineuse pendant plusieurs jours, afin de déclencher cet "empoisonnement" cellulaire. Des essais cliniques ont été réalisés chez des patients atteints de mélanomes métastatiques ou de tumeurs cérébrales (principalement glioblastomes).

Les résultats chez certains patients ont montré des diminutions de volume tumoral expliqués par un effet remarquable, nommé effet "bystander" où l'on observe que pour une cellule exprimant le gène HSV-TK, environ cinq autres cellules sont détruites par un effet de voisinage.

De nombreuses discussions sont en cours sur la réalité de cet effet "bystander" et sur les suites à y donner pour les tumeurs traitées in vivo. Ces gènes sont aussi étudiés actuellement sur des modèles animaux concernant la sensibilité de ces cellules transfectées à la radiothérapie, qui sembleraient accrue.

Depuis les premiers essais cliniques (1990), la TG connait enfin quelques succès, le plu spectaculaire étant l'amélioration physiologique de patients avec déficit en ADA.

Toutefois, il existe une telle diversité des outils, des cibles moléculaires et cellulaires, et des pathologies pouvant en bénéficier, qu'il parait difficile aujourd'hui de de parler de TG dans tel ou tel domaine sans omettre certaines avancées.

Tous les chemins de la médecine ou presque mènent à la TG. Il faudra certainement pourtant y mettre des limites d'application, ce qui commencent à se profiler.

Il n'y a pas de transfert idéal mais certains systèmes sont déjà opérationnels. Il est vrai que la TG découvre ses limites actuelles, ainsi qu'un défaut de jeunesse : le trop peu de recul vis à vis des patients traités pour pouvoir à ce jour quantifier les chances de réussites et les risques d'une TG.

Quelle sera la place donnée à la TG dans l'avenir? Certains pensent qu'il s'agit d'un mythe, d'autres sont plus optimistes et sont persuadés que dans 15 ans, elle aura une part prépondérante dans tous les traitements institués. Il ne faut pas oublier le chemin déjà parcouru depuis le premier essai de TG chez l'homme, et les efforts consacrés actuellement sur les problèmes de galénique génique.

La TG du cancer répond à ces mêmes interrogations et à ces mêmes voies prometteuses. Elle reste de plus un enjeu important, compte tenu du grand nombre de patients concernés par cette maladie.

Mais n'oublions pas, non plus, que la TG, comme toute thérapie, est tenu d'aller à l'essai clinique seulement quand cela est nécessaire et dans le respect de l'éthique scientifique et des malades.

Certains passages de ce texte ont été inspirés de réfléxions d'A KAHN et de nombreux articles traitants de la Thérapie Génique (prochainement référencés sur ce site).

Les termes ont été pour beaucoup empruntés au glossaire de J.C. Kaplan: biologie moléculaire et médecine.

ADNc: séquence d' ADN complémentaire d'un ARN messager obtenue par transcription inverse.

Amphotrope: qualifie les virus capables d'infecter les cellules de n'importe quelle espèce.

Anti-oncogène: gène suppresseur de tumeurs s'exprimant à l'état normal de manière dominante. Ses mutations sont récessives.

Apoptose: mort cellulaire programmée.

Capside: emballage protéique des génomes viraux.

CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator): Protéine dont l'altération ou la non expression est responsable de la mucoviscidose.

Cis (régulation): Action régulatrice de séquences de DNA non codantes s'exerçant sur un ou plusieurs promoteurs situés à proximité sur la même chromosome.

Délétion: perte d'une ou plusieurs paires de bases consécutives sans rupture de continuité de la molécule de DNA.

Electroporation: procédé de transfection créant, à l'aide de chocs électriques, des pores dans la membrane plasmidique, et permettant l'introduction de l'ADN de haut poids moléculaire dans des cellules eucaryotes en culture.

Enhancer: séquence d'ADN stimulant en cis la transcription de certains gènes eucaryotes. Certains facteurs protéiques interagissant avec eux peuvent leur conférer une spécificité tissulaire.

Episome: séquences d'ADN pouvant soit exister sous forme extra-chromosomique autonome, soit être insérée dans l'ADN chromosomique. Par extension, désigne les formes auto-réplicatives et extrachromosomiques.

Eucaryote: se dit des organismes cellulaires dont les noyaux sont entourés de membrane et dont le cytoplasme possède des mitochondries et des ribosomes.

Ex vivo: désigne les expériences réalisées dans des cellules vivantes en culture, souvent préliminaires à leur introduction dans un animal entier.

Gène: ensemble des séquences d'acide nucléique contenant l'information pour la production régulée d'un ARN particulier (transcription).

Génotype: constitution génétique d'un individu.

Immortalisation: acquisition par des cellules eucaryotes de la capacité de se multiplier indéfiniment in vitro. Caractéristique fondamentale des cellules cancéreuses.

Intégration: insertion d'une séquence exogène dans l'ADN génomique d'une cellule hôte.

Interleukines: substances plasmatiques sécrétées par les macrophages et certains lymphocytes et qui stimulent d'autres cellules responsables de l'immunité.

Mutation: désigne n'importe quel changement intervenu dns la séquence d'ADN.

Oncogène: originellement, gène capable de conférer expérimentalement le phénotype cancéreux (transformation) à une cellule eucaryote, et une tumeur dans un oganisme.

PCR (Polymerase Chain Reaction): amplification élective d'une séquence d'ADN double-brin, effectué in vitro. Ceci assure une duplication exponentielle de chaque brin.

Phénotype: manifestation apparente de la constitution du génome sous la forme d'un trait morphologique, d'un syndrome clinique, d'une variation qualitative ou quantitative du produit final d'expression d'un gène (protéine).

Plasmides: fragments d'ADN extra-chromosomique (épisomal) circulaire présent dans les bactéries, susceptibles de se répliquer de façon autonome.

Promoteur: région d'ADN en amont des gènes comportant le site de fixation de l'ARN polymérase ainsi que les sites de fixation de protéines régulatrices de la transcription.

Provirus: génôme rétroviral intégré sous forme d'ADN double-brin dans l'ADN de la cellule hôte.

Réparation: processus de restauration de l'intégrité d'un brin d'ADN lésé, utilisant le brin intact comme modèle.

Réplication: processus de duplication à l'identique d'une molécule d'ADN en deux molécules filles.

TIL(tumor-infiltrating lymphocytes): lymphocytes (ou cellules NK) isolés de la tumeur du malade.

Trans: Facteur diffusible capable de moduler l'activité (en + ou en -) d'un ou de plusieurs gènes en interagissant avec leur(s) séquence(s) régulatrice(s).

Transcription: synthèse d'ARN par une ARN polymérase à partir d'une matrice d'ADN.

Translocation: cassure et déplacement d'un fragment de chromosome sur un autre chromosome.

Vecteur: séquence nucléotidique capable de s'autorépliquer, utilisée pour la recombinaison in vitro de l'ADN et son amplification extra-chromosomique (clonage). Exemples: plasmides, rétrovirus, bactériophages.

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